煙堿型乙酰膽堿受體α5促進肝內膽管癌轉移
神經遞質啟動的信號通路在調節(jié)腫瘤細胞的惡性表型中發(fā)揮著重要作用。靶向失調的神經系統(tǒng)可能是癌癥治療的一種新策略。
2024年3月8日，復旦大學附屬華山醫(yī)院普外科教授欽倫秀、董瓊珠團隊在 Signal Transduction and Targeted Therapy（IF=40.3）上發(fā)表題為“Alpha5 nicotine acetylcholine receptor subunit promotes intrahepatic cholangiocarcinoma metastasis”的研究論文[1]。該研究發(fā)現(xiàn)，KN93——鈣調蛋白依賴性蛋白激酶（CAMKII）的小分子抑制劑，可顯著抑制肝內膽管癌（ICC）細胞的遷移，增強對吉西他濱的敏感性。乙酰膽堿（ACh）/煙堿型乙酰膽堿受體α5（CHRNA5）軸通過CAMKII/GSK3β信號通路增加β-catenin的表達，促進ICC轉移和對吉西他濱的耐藥。該研究提示KN93與吉西他濱聯(lián)合使用可能是一種新的ICC治療策略。
文章解析
1.研究背景
膽管癌（CCA）是一種發(fā)生在膽道不同部位的上皮細胞惡性腫瘤。根據解剖位置，CCA分為肝內膽管癌（ICC）、肝門周圍膽管癌（pCCA）和遠端膽管癌（dCCA）三種亞型，分別具有不同的腫瘤表現(xiàn)、臨床特征、治療方案和預后。手術治療是所有亞型的首選，吉西他濱和順鉑的化療方案經常用于無法手術的患者治療。但CCA的高度促結締組織增生性、復雜的腫瘤微環(huán)境以及遺傳異質性，都導致了其治療耐藥性。CCA預后極差，5年總生存率為5%-20%，而ICC約占原發(fā)性肝臟惡性腫瘤的5-10%，其發(fā)病率在全球范圍內呈上升趨勢。進一步探索ICC生物學、致癌環(huán)境及其與腫瘤微環(huán)境的復雜相互作用，從而開發(fā)新的治療策略，顯得尤為重要。
神經周圍浸潤（PNI），指的是癌細胞出現(xiàn)在神經鞘的任何層或周圍至少33%的神經纖維周長，在包括ICC在內的許多實體惡性腫瘤中都有提及。越來越多的證據表明，神經在腫瘤發(fā)生和癌癥進展的調節(jié)中起著核心作用。神經營養(yǎng)因子，如神經生長因子（NGF）、腦源性神經營養(yǎng)因子（BDNF）和膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子（GDNF），是參與神經元生長和PNI的蛋白質。
在神經發(fā)育過程中，BDNF激活TrKB信號通路，促進神經的生長。既往研究發(fā)現(xiàn)，BDNF在ICC中的表達明顯高于鄰近正常組織，且BDNF水平與PNI的發(fā)生呈正相關，提示BDNF可能在ICC中PNI的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。
乙酰膽堿（ACh）是一種典型的神經遞質，據報道可促進甲狀腺癌和胃癌的干性和進展。煙堿型乙酰膽堿受體（N-AChR）是對ACh產生響應的受體之一，作為N-AChR家族的一員，煙堿型乙酰膽堿受體α5-nAChR（CHRNA5）是可與α4β2受體形成絡合物，從而在ACh存在下提高細胞內鈣濃度，既往研究表明CHRNA5的異常表達與尼古丁成癮和肺癌的惡性表型密切相關。但人們對CHRNA5在ICC中的作用知之甚少。
2.研究內容
1、ACh通過誘導上皮-間質轉化（EMT）促進ICC轉移
PNI被認為是腫瘤細胞的一種侵襲行為。研究團隊通過分析本院152例患者的預后信息發(fā)現(xiàn)PNI是ICC不良預后的一個強有力的預測因子，最終入組了127對膽管癌和鄰近正常組織樣本。
通過酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測ICC中去甲腎上腺素（NE）和ACh的含量，發(fā)現(xiàn)PNI+ ICC中ACh水平明顯高于PNI-ICC，而NE濃度無明顯差異（圖1a和補充圖2b）。此外，免疫熒光染色分析還顯示，ICC組織中大部分PGP9.5陽性的神經纖維對副交感神經標記物-囊泡乙酰cho線轉運蛋白（VAChT）呈陽性，只有少數(shù)神經纖維對交感神經標記物酪氨酸羥化酶（TH）呈陽性（圖1b）。這些結果提示PNI在ICC中創(chuàng)造了一個富含ACh的微環(huán)境。體外實驗顯示，外源性ACh顯著刺激了EMT表型，增強了ICC細胞的遷移能力（圖1c，d和補充圖2c-f），而NE處理后無明顯影響（補充圖2g）。體內實驗還顯示，ACh處理顯著促進了CCLP1細胞肝內轉移的形成（圖1e，f），及鹽酸苯胺顯著抑制肝內轉移瘤的形成（補充圖2k，l）。這些結果表明，神經源性ACh在刺激ICC細胞EMT表型中起關鍵作用。
既往研究報道，ACh除由神經分泌外，還可由癌細胞自行合成。有趣的是，ELISA法在HuCCT1和CCLP1細胞培養(yǎng)上清中也檢測到ACh（圖1g），鹽酸苯胺處理顯著抑制ICC細胞的體外遷移能力（圖1h），提示ICC細胞可能能夠自我合成和分泌ACh來促進遷移。該研究發(fā)現(xiàn)對ACh合成至關重要的膽堿乙?；福–hAT）在ICC細胞系中呈陽性（補充圖2），并且入組隊列中約35%（44/127個ICC患者）的ChAT呈陽性（圖11）。通過敲除ICC細胞中的ChAT（補充圖2n），發(fā)現(xiàn)ChAT敲除顯著降低了ICC細胞的ACh分泌（圖1j），抑制了ICC細胞的遷移能力，外源性ACh的加入減弱了ICC細胞的遷移能力（圖1k）。
這些數(shù)據表明，來自神經分泌或ICC細胞自我合成的ACh誘導EMT表型，促進ICC轉移。
2、體外和體內實驗阻斷ACh/CHRNA5軸可抑制ICC的惡性表型
在入組隊列患者中，免疫組化染色（IHC）結果顯示，與非腫瘤膽管相比，ICC組織中CHRNA5的表達水平更高（圖2a），且CHRNA5表達水平與腫瘤大小、淋巴結轉移、TNM分期、血清丙氨酸轉氨酶（ALT）水平密切相關，高CHRNA5表達的ICC患者OS和DFS顯著縮短（圖2b和補充圖3g）。這些表明，CHRNA5與ICC的惡性表型顯著相關。通過敲除CHRNA5，檢測其在CCLP1中的表達，發(fā)現(xiàn)它顯著抑制ICC細胞的EMT表型（圖2c，d和補充圖3j），并消除了ACh誘導的ICC細胞的EMT表型（圖2e和補充圖3k），也減弱了DRG對ICC細胞遷移能力的刺激作用（補充圖3l）。在HuCCT1中過表達CHRNA5（補充圖3m，n），發(fā)現(xiàn)它可以增強ICC的EMT表型（圖2f，g和補充圖3o）。有趣的是，敲除ChAT可以抑制CHRNA5對ICC細胞遷移能力的增強作用，而這種增強作用可以通過外源添加ACh來恢復（圖2h，i）。這些結果表明，ACh/CHRNA5軸在促進ICC細胞遷移能力中起著關鍵作用。
為了進一步評估ACh/CHRNA5軸在體內的意義，研究團隊利用ICC細胞建立了肝門原位植入模型。CHRNA5敲除顯著減輕了裸鼠腫瘤性梗阻黃疸（圖2j和補充圖4a，b）；CHRNA5過表達顯著加重了腫瘤性梗阻黃疸（圖2k和補充圖4c，d）。同樣，CHRNA5敲除顯著減少了裸鼠脾移植ICC細胞后肝轉移的數(shù)量（圖2l和補充圖4e，f）；CHRNA5過表達增加了肝轉移數(shù)量（圖2m和補充圖4g，h）。然后，研究團隊構建坐骨神經侵襲模型，進一步研究ACh/CHRNA5軸在體內對ICC侵襲能力的影響。結果顯示，CHRNA5敲除降低了ICC細胞對坐骨神經軸突的包繞能力，以及侵襲神經纖維鞘的能力（圖2n和補充圖4i，j），這表明CHRNA5敲除剝奪了ICC的侵襲能力。另一方面，CHRNA5過表達增強了ICC的體內侵襲能力（圖2o和補充圖4k，1）。此外，6例淋巴結轉移的ICC患者的原發(fā)和轉移灶配對樣本的IHC結果顯示，CHRNA5在淋巴結轉移灶中的表達明顯高于原發(fā)灶（補充圖4m）。研究人員還構建了YAP/Akt驅動的ICC小鼠模型（補充圖4n），發(fā)現(xiàn)YAP/ akt驅動的腫瘤CK19陽性，HNF4α陰性（補充圖40），與ICC的歷史病理特征一致。鹽酸苯胺治療顯著降低了腫瘤負荷（補充圖4p，q），延長了YAP/Akt ICC小鼠的生存時間（圖2p）；也降低了Ki67的表達水平，并抑制了YAP/ akt驅動的ICC中EMT表型（補充圖4r）。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)支持ACh/CHRNA5軸在維持ICC的惡性表型中起關鍵作用，阻斷該軸在體外和體內均顯示出對惡性表型的抑制作用。
圖2.阻斷ACh/CHRNA5抑制ICC進展（源自論文[1]）
3、β-catenin信號通路是由ACh/CHRNA5軸驅動的惡性表型
考慮到β-catenin信號通路在腫瘤轉移中的關鍵作用，研究團隊提出ACh/ CHRNA5軸可能通過β-catenin調控ICC的EMT表型。結果顯示ICC細胞和異種移植組織中β-catenin水平相應地隨著CHRNA5的表達而升高或降低（圖3a和補充圖5d）。臨床ICC組織的IHC結果也證實了CHRNA5與β-catenin蛋白水平的正相關（圖3b）。此外，外源添加ACh可增加β-catenin的表達（補充圖5e），ACh受體抑制劑可降低YAP/Akt小鼠模型ICC組織中β-catenin的表達（圖3c）。CHRNA5的上調或下調伴隨著ICC細胞細胞核中β-catenin蛋白水平的相應升高或降低（圖3d，e）。這些結果表明ACh/CHRNA5軸在β-catenin表達中起調節(jié)作用。
先前的研究報道了β-catenin在化療耐藥中的關鍵作用，該研究也發(fā)現(xiàn)CHRNA5敲除顯著增加了對吉西他濱的反應（圖3f），而CHRNA5過表達導致了ICC細胞對吉西他濱的耐藥（圖3g）。此外，β-catenin過表達部分中和了CHRNA5敲除對CHRNA5沉默的CCLP1細胞中EMT表型的抑制作用（圖3h，i），而在CHRNA5過表達的HuCCT1細胞中，沉默β-catenin后觀察到相反的效果（圖3j，k）。這些結果表明，ACh/CHRNA5軸介導的ICC EMT表型可能部分歸因于β-catenin信號通路。
4.ACh/CHRNA5軸介導的CAMKII激活抑制GSK-3β活性以穩(wěn)定β-catenin
研究團隊隨后探索了ACh/CHRNA5軸調控β-catenin表達的機制，發(fā)現(xiàn)上調或下調CHRNA5對β-catenin mRNA表達沒有顯著影響（補充圖6a, b）。檢測了環(huán)己亞胺（CHX）處理ICC細胞在不同時間點的β-catenin蛋白水平，發(fā)現(xiàn)下調CHRNA5可顯著縮短β-catenin的半衰期（圖4a）；而CHRNA5過表達顯著延長了β-catenin的半衰期（圖4b）。此外，蛋白酶體抑制劑MG132顯著恢復了CCLP1-shCHRNA5細胞中β-catenin的表達（補充圖6c）。這表明CHRNA5可能通過蛋白酶體介導的途徑調節(jié)β-catenin的降解。
接下來研究CHRNA5是否參與β-catenin磷酸化的調控。結果證明CHRNA5參與調節(jié)β-catenin在T41, S33, S37位點的磷酸化（圖4c）和GSK3β活性（補充圖6d, e）。上調或下調CHRNA5導致相應的GSK3β Ser9磷酸化升高或降低（圖4d）。這表明CHRNA5可能通過誘導GSK3β在Ser9位點的磷酸化來調節(jié)其活性。GSK3β抑制劑LiCl，可減弱CHRNA5敲除對β-catenin活性和ICC遷移能力的抑制作用（圖4e，f）。進一步在CHRNA5過表達的HuCCT1細胞中過表達突變的GSK3β（S9A）蛋白中，觀察到GSK3β（S9A）蛋白對ICC細胞β-catenin表達和遷移能力的抑制作用比野生型GSK3β蛋白更顯著（圖4h）。這些都表明，CHRNA5通過誘導GSK3β在Ser9位點的磷酸化使其失活，從而進一步增加了β-catenin蛋白的穩(wěn)定性，促進ICC轉移。
通過免疫共沉淀法和質譜分析，確定CAMKII是與GSK3β相互作用的候選蛋白（補充圖6f），并推測CAMKII可能在ACh/CHRNA5軸介導的GSK3β Ser9磷酸化中發(fā)揮重要作用。CAMKII活性與細胞內Ca2+濃度密切相關，ACh/ CHRNA5軸顯著增加細胞內Ca2+濃度（補充圖6g）。此外，CHRNA5下調或上調誘導CAMKII活性顯著降低或增加（圖4i；補充圖6h），鹽酸苯胺處理顯著降低了YAP/Akt ICC小鼠的p-CAMKII水平（補充圖6i）。此外，共免疫沉淀實驗表明CAMKII可以與野生型GSK3β相互作用，而不是與Ser9突變型GSK3β（S9A）相互作用（圖4j）。CAMKII蛋白與GSK3β結合的量通過敲除CHRNA5而顯著減少，并通過CHRNA5過表達而增加（圖4k）。同樣，CAMKII抑制劑KN93顯著降低了ICC中p-GSK3β（S9）和β-catenin的表達（圖4l），并顯著抑制ICC的EMT表型（補充圖6j，k）。這些發(fā)現(xiàn)表明，ACh/CHRNA5軸可以激活CAMKII，從而抑制GSK-3β活性，穩(wěn)定β-catenin。
圖4.ACh/CHRNA5軸介導的CAMKII激活抑制GSK-3β活性以穩(wěn)定β-catenin（源自論文[1]）
5、ACh/CHRNA5軸促進ICC分泌BDNF，誘導軸突發(fā)生
ACh信號傳導曾被報道在胃癌中誘導軸突發(fā)生。為了探索ACh信號是否能誘導ICC軸突發(fā)生，研究團隊進一步通過IHC檢測ICC異種移植物中PGP9.5的表達水平，發(fā)現(xiàn)上調或下調CHRNA5會導致ICC異種移植物腫瘤軸突發(fā)生相應的增加或減少（圖5a, b）。乙酰膽堿受體抑制劑顯著降低YAP/Akt小鼠的軸原分泌（補充圖7a）。為了進一步驗證ACh/ CHRNA5軸在體外軸突發(fā)生中的調節(jié)作用，收集ICC細胞條件培養(yǎng)基處理DRG，采用免疫熒光染色法檢測DRG軸突新生情況。結果顯示，在CCLP1細胞中，CHRNA5敲低顯著降低了誘導神經突生長的能力（圖5c），但在HuCCT1細胞中，CHRNA5過表達增強了誘導神經突生長的能力（圖5d），這表明ACh/CHRNA5軸參與了ICC軸突發(fā)生的調節(jié)。
隨后探討了ACh/CHRNA5軸如何調節(jié)ICC的軸突發(fā)生。由于BDNF通過激活TrKB受體在軸突發(fā)生中發(fā)揮重要作用，研究團隊檢測了BDNF在ICC細胞中的表達水平，發(fā)現(xiàn)在敲除CHRNA5后，BDNF的表達水平顯著降低（圖5e；補充圖7g），并且CHRNA5過表達顯著增加BDNF水平（圖5f；補充圖7h）。這些結果與ELISA檢測的ICC異種移植組織中的結果一致（補充圖7i, j）。此外，乙酰膽堿受體抑制劑顯著降低了YAP/Akt ICC小鼠的BDNF水平（補充圖7k）。BDNF受體抑制劑ANA-12顯著抑制了CHRNA5增加ICC軸突發(fā)生的能力（補充圖 7l），表明BDNF在CHRNA5促進ICC軸突發(fā)生中發(fā)揮了關鍵作用。ANA-12可顯著降低YAP/Akt ICC小鼠的腫瘤負荷（補充圖7m）、軸突發(fā)生以及p-CAMKII和β-catenin的表達水平（圖5g）。這表明，ACh/CHRNA5軸介導的BDNF上調促進了神經的生長，相應地，神經可以進一步提高ACh/CHRNA5軸及其下游CAMKII/GSK3β/β-catenin信號的活性，從而形成一個正反饋回路，促進ICC的進展。
研究團隊發(fā)現(xiàn)β-catenin抑制劑ICG- 001顯著抑制ICC細胞中BDNF的表達水平（圖5h, i），與之前報道的β-catenin可啟動神經元和神經膠質細胞中BDNF轉錄表達的觀點相一致。因此，研究團隊猜測ACh/CHRNA5軸可能通過β-catenin調節(jié)BDNF的表達水平?；赥CGA數(shù)據庫發(fā)現(xiàn)CTNNB1與ICC中的BDNF呈正相關（補充圖7n）。CTNNB1的敲除降低了BDNF的表達水平（圖5j）；CTNNB1的過表達增加了ICC中BDNF的表達水平（圖5k）；CAMKII抑制劑KN93降低了BDNF的表達，而GSK3β抑制劑增加了BDNF的表達（補充圖7o），表明CAMKII/ GSK3β/β-catenin信號通路在BDNF的表達中起調節(jié)作用。上述所有這些結果提示在ICC中，ACh/CHRNA5軸介導的β-catenin上調上調BDNF的表達，誘導神經的生長，而神經又進一步激活ICC中ACh/CHRNA5軸，在ICC細胞和神經之間形成正反饋回路，促進ICC的進展。為進一步鞏固此結論，研究團隊通過多重免疫組化（mIHC）實驗探討了p-CAMKII、p-GSK3β、β-catenin、BDNF和PGP9.5在人ICC樣本中的表達情況。mIHC結果顯示，p-CAMKII、p-GSK3β、β-catenin和BDNF的表達在靠近神經的ICC細胞中顯著升高（圖5l），提示神經可能介導ICC中CAMKII/GSK3β/β-catenin信號的激活，并增加BDNF的表達，從而進一步誘導神經的生長。
圖5.ACh/CHRNA5軸促進ICC分泌BDNF，誘導軸突發(fā)生（源自論文[1]）
6、CAMKII抑制劑KN93和吉西他濱聯(lián)合治療在ICC中顯示出增強的抗腫瘤活性
鑒于CAMKII在調節(jié)β-catenin活性中發(fā)揮重要作用，而β-catenin是ICC化療敏感性的關鍵調節(jié)因子，于是研究團隊猜想CAMKII活性可能與ICC的化療反應密切相關。為了進一步探索CAMKII活性與ICC患者吉西他濱療效的潛在相關性，研究團隊收集了19例接受吉西他濱為基礎化療的ICC患者樣本。IHC結果顯示對吉西他濱化療耐藥的ICC患者p-CAMKII表達水平較高（圖6a），提示CAMKII可能作為ICC的治療靶點。體外實驗顯示，CAMKII抑制劑KN93可增加吉西他濱的敏感性（圖6b），KN93與吉西他濱具有協(xié)同抗腫瘤作用（圖6c）。體內實驗進一步證實了KN93和吉西他濱聯(lián)合治療比單藥治療更有效（圖6d，e），并且在接受不同治療的小鼠中未觀察到這些藥物的明顯毒性（圖6f）。此外，聯(lián)合用藥能更大程度地誘導細胞凋亡并抑制Ki67的表達（圖6g，h）。綜上，抑制CAMKII可抑制ICC的惡性表型并增加其對吉西他濱的敏感性，KN93聯(lián)合吉西他濱可能是治療ICC的一種新的治療策略。
本研究涉及的mIHC實驗中TSA染料來自艾克發(fā)生物的AlphaXTSA®多靶點免疫組化染色試劑盒（5標6色XTSA480/XTSA520/XTSA570/XTSA620/XTSA690），標記CK19/PGP9.5/P-CAMK II/P-GSK3β/β-catenin/BDNF蛋白，直觀檢測顯示不同靶標的表達情況。
總結
本研究利用127對ICC癌和正常組織樣本，并建立裸鼠異種移植瘤模型和肝轉移模型，通過RNA-seq、mIHC、ELISA等技術分析，發(fā)現(xiàn)ICC細胞和浸潤的神經可以形成富含ACh的腫瘤微環(huán)境，ACh通過誘導EMT促進ICC轉移。ACh通過與CHRNA5的相互作用促進ICC轉移。ACh/CHRNA5軸部分通過Ca2+介導的CAMKII的激活來激活GSK3β/β-catenin信號通路。此外，ACh信號激活還通過增加BDNF的表達來擴大神經浸潤，BDNF形成前饋ACh-BDNF軸以促進ICC進展。KN93是CaMKII的小分子抑制劑，可顯著抑制ICC細胞的遷移，增強其對吉西他濱的敏感性?？傮w結果提示KN93與吉西他濱聯(lián)合使用可能是一種新的ICC治療策略，特別是對PNI患者。
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