結(jié)直腸癌（CRC）是全球癌癥相關(guān)死亡的第二大原因。盡管早期發(fā)現(xiàn)和治療取得了進(jìn)展，但晚期CRC的預(yù)后仍然不佳，這強(qiáng)調(diào)了迫切需要新的治療策略。近年來，免疫療法，尤其是針對PD-1/PD-L1和CTLA-4的免疫檢查點(diǎn)抑制劑，已成為一種有希望的CRC治療方法。這些療法在高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI-H）或錯(cuò)配修復(fù)缺陷（dMMR）型患者亞群中顯示出可觀的臨床益處。然而，大多數(shù)CRC患者以微衛(wèi)星穩(wěn)定性（MSS）為特征，對免疫治療的反應(yīng)有限，因此需要改進(jìn)預(yù)測方法和新策略來提高免疫治療在更廣泛的CRC患者群體中的有效性。如何精準(zhǔn)預(yù)測免疫治療響應(yīng)并開發(fā)增效策略，是當(dāng)前研究的關(guān)鍵挑戰(zhàn)。 為了構(gòu)建CRC患者的免疫亞型，研究團(tuán)隊(duì)收集了來自TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫的公共數(shù)據(jù)，包括臨床信息和RNA-seq數(shù)據(jù)。通過單樣本基因集富集分析（ssGSEA）和分層聚類，將CRC患者分為高、中、低免疫浸潤亞型（Cluster 3/2/1）。其中高浸潤亞型（Cluster 3）富集CD8+ T細(xì)胞、NK細(xì)胞和M1巨噬細(xì)胞，MSI-H比例高，提示免疫治療敏感性；而中浸潤亞型（Cluster 2）預(yù)后最佳，可能與免疫抑制性微環(huán)境動(dòng)態(tài)平衡有關(guān)。 2.基于機(jī)器學(xué)習(xí)模型預(yù)測CRC患者免疫治療敏感性 3.使用內(nèi)部隊(duì)列和臨床標(biāo)本驗(yàn)證預(yù)測模型 為了進(jìn)一步驗(yàn)證該模型在實(shí)際應(yīng)用中的性能，研究團(tuán)隊(duì)收集了45例患者的標(biāo)本，同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序和類器官培養(yǎng)。根據(jù)13個(gè)關(guān)鍵基因的表達(dá)譜，這些患者被分為高評(píng)分組和低評(píng)分組。研究者采用多重免疫組化（mIHC）檢測臨床樣本中CD8+T細(xì)胞、PD-1/PD-L1表達(dá)及Foxp3+Treg細(xì)胞分布，在高評(píng)分組中CD8+T和CD56+NK細(xì)胞顯著增加，兩者都與腫瘤殺傷有關(guān)；免疫檢查點(diǎn)PD-1和PD-L1的高表達(dá)水平表明高評(píng)分組患者將從免疫治療中獲益更多。為了評(píng)估CRC患者對PD-1抗體的反應(yīng)性，研究團(tuán)隊(duì)又構(gòu)建了具有天然腫瘤浸潤性免疫細(xì)胞的患者來源的類器官（PDOs），并用Nivolumab治療。Ki67免疫熒光染色結(jié)果顯示，抗PD-1治療后，高評(píng)分類器官的增殖能力明顯受損，有效抑制了腫瘤的生長。因此，來自臨床樣本的驗(yàn)證結(jié)果證實(shí)了該模型的高準(zhǔn)確性和可靠性。 4.基于免疫亞型的藥物篩選確定I-OMe-AG-538是增強(qiáng)抗腫瘤免疫的潛在藥物 免疫亞型分析顯示了區(qū)分個(gè)體對免疫治療敏感性的強(qiáng)大能力。為了進(jìn)一步將免疫治療的益處擴(kuò)展到更多的CRC患者，基于高（Cluster 3）和低（Cluster 1）免疫浸潤組之間前100個(gè)最顯著的上調(diào)和下調(diào)基因來識(shí)別可能增強(qiáng)抗腫瘤免疫的潛在藥物。PBMCs和腫瘤細(xì)胞的體外共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)顯示，與其他藥物相比，AG-538增強(qiáng)PBMCs介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞殺傷效果最為顯著。進(jìn)一步研究表明，AG-538通過調(diào)節(jié)趨化因子表達(dá)激活抗腫瘤免疫應(yīng)答，顯著提高CCL5和CXCL10水平。隨后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AG-538增強(qiáng)了兩種細(xì)胞對抗PD-1治療的敏感性，并有效促進(jìn)了細(xì)胞活化相關(guān)細(xì)胞因子lFN-γ、GzmB和TNF-α的分泌，但AG-538的作用依賴于抑制IGF1R。此外，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明AG-538預(yù)處理的CRC細(xì)胞仍然表現(xiàn)出更大的腫瘤易感性，而AG-538預(yù)處理的PBMC對CRC細(xì)胞并沒有產(chǎn)生更強(qiáng)的細(xì)胞毒性作用，這表明AG-538主要通過對腫瘤細(xì)胞的作用間接激活抗腫瘤免疫，而不是直接作用于免疫細(xì)胞。 5.I-OMe-AG-538增強(qiáng)體內(nèi)的抗腫瘤免疫反應(yīng) 6.AG-538誘導(dǎo)活性氧（ROS）依賴的DNA損傷，下調(diào)多修復(fù)基因的表達(dá) 受損的DNA是誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的重要因素。為了探究AG-538作為IGF1R抑制是否與DNA損傷有關(guān)，研究團(tuán)隊(duì)檢測了AG-538處理后的DNA損傷生物標(biāo)志物γH2AX和53BP1。結(jié)果表明，AG-538顯著增強(qiáng)細(xì)胞DNA損傷水平。此外，敲除IGF1R也增加了DNA損傷的程度，但AG-538未能進(jìn)一步加劇IGF1R敲除細(xì)胞的DNA損傷。qPCR結(jié)果等多種分子實(shí)驗(yàn)和蛋白實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AG-538不僅通過產(chǎn)生ROS誘導(dǎo)DNA損傷，而且通過抑制多修復(fù)基因的表達(dá)加重DNA損傷。 為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)AG-538的抗腫瘤免疫作用是否依賴于cGAS/STING通路，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)。PBMC共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)及MC38小鼠腫瘤模型敲除實(shí)驗(yàn)均證實(shí)STlNG低表達(dá)及不表達(dá)都明顯損害了AG-538的治療效果，表明AG-538誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫依賴于腫瘤固有的cGAS-STING激活；流式細(xì)胞術(shù)和IHC結(jié)果均顯示在STING抑制或敲除的小鼠MC38同種異體移植物中，AG-538未能誘導(dǎo)lFN-γ+CD8+T細(xì)胞、GzmB+CD8+T細(xì)胞的浸潤增加。這些結(jié)果共同表明AG-538激活了TME的內(nèi)在免疫反應(yīng)，促進(jìn)了免疫細(xì)胞的浸潤和活化，為CRC患者免疫治療的有效性提高提供了新的理論依據(jù)。 為進(jìn)一步探討IGF1R通路在CRC免疫治療中的臨床意義，研究團(tuán)隊(duì)對20例接受免疫治療的CRC患者的標(biāo)本及其臨床特征信息進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)在plGF1R低表達(dá)組中應(yīng)答者的百分比更高，并且應(yīng)答者的plGF1R低于無應(yīng)答者，且plGF1R低表達(dá)組預(yù)后明顯優(yōu)于高表達(dá)的患者。為了進(jìn)一步探索上述免疫評(píng)分與IGF1R通路激活之間的關(guān)系，將內(nèi)部標(biāo)本分為高評(píng)分組和低評(píng)分組，lHC結(jié)果顯示高評(píng)分組plGF1R的表達(dá)較低。對AG-538處理的CRC細(xì)胞檢測13個(gè)關(guān)鍵基因的表達(dá)，在Z-score歸一化后，計(jì)算免疫評(píng)分，發(fā)現(xiàn)AG-538治療后這些評(píng)分顯著升高。這些發(fā)現(xiàn)不僅強(qiáng)調(diào)了預(yù)測模型的穩(wěn)健性，而且證實(shí)了AG-538抑制plGF1R在引發(fā)抗腫瘤免疫應(yīng)答中的有效性。 本研究中涉及的mIHC實(shí)驗(yàn)（Panel：CD8、CD68、CD56、PD-1、PD-L1、PANCK、DAPI）利用艾克發(fā)生物的XTSA®染料及相關(guān)試劑直觀檢測到高/低免疫評(píng)分患者的細(xì)胞亞群分布情況，凸顯了mIHC在TME分析中的獨(dú)特優(yōu)勢。 本研究通過整合多組學(xué)數(shù)據(jù)與機(jī)器學(xué)習(xí)算法，構(gòu)建了基于免疫亞型的預(yù)測模型，為CRC患者分層治療提供了新工具；篩選出的新型IGF1R抑制劑AG-538，可顯著增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)，并突顯了AG-538與抗PD-1抗體聯(lián)合使用的潛力，作為一種化療免疫治療策略，這為個(gè)性化治療鋪平了道路。 全文獲取： 關(guān)注公眾號(hào)，后臺(tái)回復(fù)“CRC”獲取文獻(xiàn)原文 艾克發(fā)生物成立于2018年，總部位于北京，核心團(tuán)隊(duì)成員均畢業(yè)于國內(nèi)外著名高校，具備豐富的空間及功能組學(xué)產(chǎn)品開發(fā)和臨床轉(zhuǎn)化經(jīng)驗(yàn)。 參考文獻(xiàn)
圖2. 基于機(jī)器學(xué)習(xí)模型預(yù)測CRC患者免疫治療敏感性（源自論文[1]）
圖4.基于免疫亞型的藥物篩選確定I-OMe-AG-538是增強(qiáng)抗腫瘤免疫的潛在藥物（源自論文[1]）
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